【原创】cmv 特异性t细胞检测在造血干细胞移植中的应用-尊龙凯时

 巨细胞病毒（cytomegalovirus，简称cmv），为人疱疹病毒5型，能够在人体建立终身持续感染，可导致人群广泛感染，其感染率高达70%-100%。在造血干细胞和器官移植领域，由于人群较高的cmv感染率，患者自身可能携带cmv，移植组织或者器官也可能携带cmv。造血干细胞移植（haematopoietic stem cell transplant，hsct）后，为了预防免疫排斥反应的发生，提高移植成功率，临床上会使用免疫抑制剂来抑制免疫系统的功能，此时受者体内或者外源移植物中潜伏感染的cmv病毒重新激活。移植患者的cmv感染/激活发生率可达80%，可发展为cmv疾病，造成患者的不同器官损伤，具有高的病死率。尽管预防或抢先治疗已经得到广泛应用，仍有2-17%的患者发生cmv疾病[1-2]。目前，cmv病毒感染相关检测包括cmv核酸和cmv抗体检测等方法。

 实时定量pcr（rt-qpcr）检测cmv-dna：cmv病毒载量可以采用定量pcr法测定病毒dna拷贝数，目前是cmv病毒血症和cmv病的一种常见临床诊断手段。其中血标本rt-qpcr因其高敏感性，成为cmv病毒血症首选的诊断技术。但rt-qpcr也存在一些局限性，如检测方法尚未统一，不同检测技术的结果具有较大差异。

 cmv特异igg 和 igm抗体检测：通过elisa等方法检测cmv特异igm抗体和igg抗体水平可提示感染状态。但是，cmv特异抗体水平免疫检测反映的是体液免疫，而cmv病毒的清除则需要细胞免疫中病毒特异效应t细胞发挥靶细胞杀伤作用。另一方面，cmv特异抗体水平免疫检测虽然可用于辅助诊断cmv病毒感染状态，但是存在抗体滴度随时间变化和细胞的抗体分泌能力差异，因此抗体检测往往用于定性。

 由于机体cmv特异的细胞免疫水平对cmv激活的长期控制至关重要，因此开发新的cmv特异免疫检测手段及时预测cmv感染风险并进行患者风险分层，提高移植手术成功率和延长患者生存期，对临床防治cmv感染具有较大的意义。

 02、cmv特异性t细胞及其检测方法

 cmv感染后，机体的固有免疫和适应性免疫应答先后被激活。在适应性免疫应答中，b细胞经过生发中心反应，高亲和力和特异性的细胞被选择，并大量克隆扩增，分泌抗体对抗病毒感染。同时，抗原提呈细胞或其他cmv感染的靶细胞表面的mhc分子结合并提呈加工处理后的cmv抗原短肽，会被cmv特异性cd4 辅助t细胞或cd8 细胞毒性t细胞的tcr特异识别，通过释放干扰素-γ (ifn-γ) 和肿瘤坏死因子-α (tnf-α)等细胞因子，或者直接杀伤靶细胞，来有效控制机体cmv病毒的活动感染。

 t细胞免疫对于机体控制cmv复制和防止进展成为cmv疾病至关重要[3-7]。机体对cmv的清除主要依赖细胞免疫，尤其是cd8 细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，ctl)对感染细胞的杀伤来完成，故ctl在抗cmv感染中起重要作用。如何更加精确的评估移植后患者对cmv特异性t细胞免疫状态,对指导抗cmv治疗有现实意义,有助于避免对所有移植后患者常规持续给予抗cmv药物而影响cmv特异性t细胞。cmv病毒载量检测联合cmv特异性t细胞免疫监测有利于了解机体防御cmv感染/激活的免疫保护能力，识别cmv临床相关并发症增加的患者。

 图 1 elispot实验原理

 基于酶联免疫斑点实验（enzyme-linked immunospot assay, elispot）的cmv elispot方法是一种快速的、高灵敏度的和单细胞水平的cmv抗原特异性t细胞免疫检测方法。由于在疫苗研发和免疫治疗等前沿领域，elispot检测的科学意义已被广泛认可并得以应用，因此成为cmv特异t细胞频数检测的可靠工具。具体原理是通过抗原递呈细胞表面的mhc分子递呈cmv抗原肽，与cmv特异性t细胞表面的tcr结合并相互作用产生细胞因子ifn-γ，用抗体捕获培养细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来，通过酶联免疫斑点分析仪对斑点进行自动计数和分析，最终通过检测产生ifn-γ的细胞数目来评估cmv特异性t细胞免疫状态（图1）。

 03、cmv特异性t细胞检测及临床意义

 cmv elispot方法当前在移植领域广泛开展，在预测cmv感染发生风险，指导预防性抗病毒治疗方面显示了巨大的应用前景。

 1.术后，监测cmv特异性t细胞免疫重建，提示发生cmv激活风险

 在一项前瞻性多中心研究中，选取241例cmv血清状态阳性的同种异体造血干细胞移植受者，从移植前到移植后6个月通过cmv elispot检测评估cmv-cmi（cmv cell-mediated immunity）。结果显示，移植后低cmv特异性t细胞免疫反应（ie-1抗原刺激下分泌ifn-γ的t细胞频数≤50 sfcs/2.5×105 pbmcs）与cmv激活发生高风险有关（hr=3.37，95% ci = 1.04-10.93）（图2）。即在有cs-cmvi（clinically significant cmv infection）的患者中，cmv-cmi水平较低(94%)。

 另几项研究中，对接受莱特莫韦预防的患者组和接受抢先治疗的患者组，分析了两组的移植物抗宿主病（gvhd）、中性粒细胞减少症、基线疾病复发率和总生存率。发现莱特莫韦预防会延迟cmv感染和cmv特异性免疫重建，需要在停止预防后实施免疫学和病毒学监测[4-6]。因此，应用t-spot.cmv检测cmv-cmi有助于临床监测allo-hct受者的cmv特异细胞免疫水平变化，并区分需要抗病毒预防或治疗的cs-cmvi风险人群和受到保护的人群。

 图 2 不同临界值下，cmv-cmi水平与cs-cmvi累积发生率

 2.术后，联合cmv dna载量检测结果，更好的帮助临床决定抗病毒治疗方案

 在一项多中心hsct患者抢先抗cmv处理的研究中，通过联合病毒学和免疫学的手段进行免疫监测，发现cmv免疫水平在接受抗病毒处理后30天内恢复至一定水平（定义为pp65/ie1特异性cd8 t细胞水平＞1 cell/ul）（图3），可以终止抗病毒治疗[6]，在一定程度上减少了非必要的抗病毒治疗，潜在的避免了对移植患者的药物毒性，以及降低治疗费用。

 图 3 免疫学和病毒学监测指导抗病毒治疗后两个月内cmv dnaemia累积发生率

 因此，cmv elispot免疫检测具备的高灵敏度、单细胞水平和绝对定量等优势，不仅在科研和医药研发领域发挥重要作用，也对造血干细胞移植后患者的病毒特异细胞免疫评价，移植和生存质量提升具有重要意义。cmv elispot免疫检测的推广，使得临床医师可以从免疫的角度评估病毒感染，助力“精准医学”目标的实现。

 总结

 cmv激活是异基因造血干细胞移植（allo-hsct）受者发病和死亡的主要原因之一。细胞介导的免疫反应对于防止潜伏感染个体的cmv激活非常重要，并被认为是预防cmv复制的主要防御机制。

 监测cmv特异性t细胞免疫可以反应异基因造血干细胞移植术后免疫重建情况，结合病毒载量检测，提示cmv复制和发展为cmv疾病的风险，更好的帮助临床决定抗病毒治疗方案。有利于减少cmv监测的持续时间和强度，减少在cmv感染风险较低的患者中抗cmv治疗的成本和药物副作用。

 对于hsct患者术后cmv激活的监测管理，荻硕贝肯可提供cmv dna载量检测和cmv elispot检测，对术后cmv感染的防治策略具有重要的指导意义，也能使临床更加科学地管理cmv感染。

 参考文献

 [1]2023csco造血干细胞移植治疗血液系统疾病指南

 [2]异基因造血干细胞移植患者巨细胞病毒感染管理中国专家共识（2022年版）

 [3]chemaly rf, el haddad l, winston dj, et al. cytomegalovirus (cmv) cell-mediated immunity and cmv infection after allogeneic hematopoietic cell transplantation: the react study. clin infect dis. 2020;71(9):2365-2374. doi:10.1093/cid/ciz1210

 [4]gabanti e, borsani o, colombo aa, et al. human cytomegalovirus-specific t-cell reconstitution and late-onset cytomegalovirus infection in hematopoietic stem cell transplantation recipients following letermovir prophylaxis. transplant cell ther. 2022;28(4):211.e1-211.e9. doi:10.1016/j.jtct.2022.01.008

 [5]zavaglio f, vitello d, bergami f, et al. human cytomegalovirus (hcmv) – specific t-cell response after letermovir prophylaxis is predictive for subsequent hcmv reactivation in haematopoietic stem cell transplant recipients.
j clin virol. 2023;165:105519. doi:10.1016/j.jcv.2023.105519

 [6]navarro d, amat p, de la cámara r, et al. efficacy and safety of a preemptive antiviral therapy strategy based on combined virological and immunological monitoring for active cytomegalovirus infection in allogeneic stem cell transplant recipients. open forum infect dis. 2016;3(2):ofw107. doi:10.1093/ofid/ofw107

 [7]yong mk, lewin sr, manuel o. immune monitoring for cmv in
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