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数字pcr技术在嵌合检测中的应用
【原创】
同种异基因造血干细胞移植 (allo-hsct)是治疗恶性血液病和免疫缺陷性疾病的有效手段之一，移植成功与否与供者细胞在受者体内的植入情况，即嵌合体的形成有关。供者细胞嵌合率 (donor chimerism，dc) 指 allo-hsct 后供者来源造血干细胞存在于受者体内的现象。移植后动态检测嵌合状态对判断植入效果 、实施临床早期干预治疗尤为重要。
嵌合检测方法简介
利用荧光标记的多重 pcr扩增短串联重复序列 (pcr-str)结合毛细管电泳检测供者细胞嵌合率 (dc)是目前嵌合检测的金标准[1]，但是其灵敏度只有1-5%，对于达到完全嵌合后患者细胞占比无法检测，目前只适用于常规嵌合（大嵌合）临床检测。
微嵌合是指患者或供者在嵌合体中占比低于1%的状态，需利用基于荧光pcr的微嵌合检测技术进行。微嵌合检测利用供受者之间的indel(插入缺失)多态性寻找差异位点，通过荧光pcr扩增的δδct值（每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数）来计算供者（或患者）细胞占比[2]。基于荧光定量pcr反应的微嵌合检测灵敏度高（可达10-4），但是在荧光pcr反应中ct值受扩增效率影响，故无法区分变化不大（一般小于一个数量级）标本。因而目前荧光pcr仪只能做微嵌合检测，而不适用于常规嵌合（大嵌合）的临床检测。
数字pcr的概念在20世纪90年代提出，原理是将一个pcr反应分成多个反应。将模板分子分成成千上万的水滴或者油滴，将pcr反应转化为数字信号，以绝对定量输出信号。数字pcr有高灵敏度、高准确度、高耐受性的优势，相比于荧光pcr，不依赖于ct值和标准曲线，不受引物和酶扩增效率影响，实现绝对定量检测[3]。数字pcr目前已广泛应用于肿瘤致病位点及耐药位点变异检测、融合基因检测、基因表达、拷贝数变异及病毒定量检测等各个领域。
数字pcr嵌合检测优势
近几年数字pcr在嵌合检测中也得到了广泛应用[3-10]，其检测原理与微嵌合相似，利用供受者之间的indel(插入缺失)多态性寻找差异位点，通过对差异位点进行数字pcr绝对定量。相比pcr-str其优势主要有灵敏度高，样本投入量少；相比荧光pcr 微嵌合其优势为不受扩增效率影响，重复性好，适用于常规嵌合（大嵌合）的临床检测（表1）。
表1：三种嵌合检测方法对比
数字pcr嵌合临床应用
微移植；脐血辅助移植[7]；
器官移植[8]；
样本量少需要做常规嵌合：例如分选后的treg细胞；cd34 细胞[9] ；
常规达到完全嵌合后监测患者嵌合率，更早预测复发[10]。
参考文献：
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